24-乙酰泽泻醇A对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MMP-9表达的影响

 [关键词] 24-乙酰泽泻醇A； 血管平滑肌细胞； 基质金属蛋白酶9；
[摘要] 目的 探讨24-乙酰泽泻醇A对氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的大鼠血管平滑肌细胞MMP-9表达的影响，阐明其抗动脉粥样硬化的机制。方法 采用酶消化法培养大鼠VSMCs，在Ox-LDL(50 mg／L)、24-乙酰泽泻醇A(10ug/mL)作用下，分为空白对照组、Ox-LDL组和泽泻A组3组，RT-PCR检测VSMCs MMP-9 mRNA的表达，用Western blotting检测MMP-9蛋白表达的变化。结果 与空白对照组比较，Ox-LDL刺激VSMCs，MMP-9 mRNA和蛋白的表达上调(P<0．05)；而24-乙酰泽泻醇A(10ug/ml)能抑制Ox-LDL诱导的VSMCs的MMP-9 mRNA和蛋白的表达。结论 24-乙酰泽泻醇A能抑制Ox-LDL诱导的大鼠VSMCs的迁移，抑制其MMP-9的表达，为动脉粥样硬化的临床治疗提供了新的方法。
[中图分类号] R363 [文献标识码] A
[基金项目]福建省卫生厅中医药科研项目（WZSY201304）,福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目（2013-ZQN-20-28）,国家自然科学基金面上项目（81473744）
作者简介：周晓茂(1988- )，女，福建中医药大学硕士研究生，研究方向为脑血管病的基础和康复研究。
通讯作者：薛偕华(1978-)，男，福建中医药大学附属康复医院，副主任医师，研究方向为动脉粥样硬化的基础和临床研究。
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础之一。研究表明，氧化损伤在AS及其并发症的发生和发展过程中起到重要作用[1]。氧化性低密度脂蛋白（Ox-LDL）能促进泡沫细胞形成及血管平滑肌细胞增殖和迁移，导致动脉粥样硬化[2]。而细胞外基质( extracellular matrixc,ECM )和基底膜的降解则是VSMCs迁移的前提条件。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一个蛋白酶家族，由巨噬细胞、VSMC等细胞产生，可广泛降解ECM。其中MMP-9是MMPs家族的重要成员,在VSMCs迁移至血管内膜、新生内膜的形成、血管的重构及不稳定性斑块破裂中发挥重要的促进作用[3，4]。泽泻为利水渗湿之要药，24-乙酰泽泻醇A为泽泻中主要含有的萜类有效成分。研究表明，泽泻中三萜类化合物是其利尿、降血脂、抗动脉粥样硬化的主要物质基础[5,6]。但目前24-乙酰泽泻醇A抗As的机制迄今尚不清楚，尚未见其对MMP-9的表达影响的相关研究。本研究以Ox-LDL诱导的大鼠VSMCs为模型，观察24-乙酰泽泻醇A对VSMCs迁移MMP-9表达的影响以探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1．1 主要材料
DMEM/F-12培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；清洁级SD雄性大鼠4只，购自福建医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK(闽)2012-0001)；氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL 1．32 mg／L)(北京协生生物科技公司)；24-乙酰泽泻醇A购自上海康标有限公司；RT-PCR试剂盒、Trizol(Promega公司)；MMP-9 PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；ECL试剂（北京碧云天有限公司）；山羊抗兔二抗(碧云天生物技术研究所)；兔抗大鼠MMP-9、β-actin一抗(CST公司)；Western blot电泳设备（Bio-RAD公司）；细胞培养箱(Therom公司)，Leica DMIL LED倒置显微镜。
1．2 大鼠VSMCs分离及培养
雄性SD大鼠以颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离出胸主动脉，刮去内、外膜，将组织剪成1 mm×1mm大小的组织块,加入II型胶原酶，37℃消化30 min后，加入含20％胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5％ CO2孵箱中培养，5～7 d细胞从组织块周围爬出并生长融合，传代，用含10％胎牛血清的DMEM培养，每隔2～3 d换液1次，胰酶消化传代。3～6代细胞用于实验研究。
1．3 细胞干预分组
取上述对数生长期细胞，接种于6孔培养板培养24 h后，换不含血清的DMEM培养24 h，使细胞生长同步于G0期。根据不同处理将细胞分为3组：(1)空白对照组：不加任何干预剂,24h后收集细胞；(2)Ox-LDL组：加Ox-LDL 50 mg／L，24 h后收集细胞；(3)泽泻A组：24-乙酰泽泻醇A 10ug/ml预孵育1 h，然后加Ox-LDL 50 mg／L刺激，24 h后收集细胞；每组实验重复3次。
1．4 RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达
用Trizol试剂(Gibco公司)提取总RNA，取1ug各组细胞总RNA逆转录合成cDNA，再各取2uL逆转录产物分别进行PCR。MMP-9的引物序列为：上游 5 -CAAGGACGGTCGGTATTGGAAG-3，下游5-AAACGAGTAACGCTCTGGGGAT-3 ，扩增片段长度为348 bp。内参照GAPDH引物序列为：上游引物为5-GTGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3，下游引物为5-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3，扩增片段长度为149bp。扩增条件：95℃变性 45 S；54℃退火 45 S；72℃延伸 1 min；30个循环，然后72℃ 延伸2 min。取3 ul产物在1．5％琼脂糖凝胶中，100 V电泳18 min，紫外灯下拍照，对电泳带进行吸光度扫描，以MMP-9／GAPDH代表MMP-9 mRNA的相对表达量。实验独立重复3次。
1．5 Western blot检测MMP-9、p-ERK和ERK蛋白的表达
细胞经胰酶消化后吹打离心，加入100ul裂解缓冲液裂解，充分研磨后 离心，吸取上清，测样品蛋白变性，SDS-PAGE电泳，转膜后，将PVDF膜取出用封闭液封闭2h，分别加入抗MMP-9、 β-actin(1：1 000)抗体孵育，4℃ 过夜，加入相应二抗(1：5 000)室温60min。将PVDF膜放图像扫描仪上，避光配置显色液并覆盖PVDF膜，反应lmin后运行Image-lab软件并进行分析处理。
1. 6 统计学方法
实验均重复3次。采用SPSS 18．0软件分析数据，计量资料以均数±标准差()表示。多组均数比较采用单因素方差分析(One—way ANOVA)；以P<0．05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠VSMCs培养与鉴定
倒置相差显微镜下单个平滑肌细胞呈梭形或不规则三角形，有多个细胞突起，胞质丰富，密度高，核圆形居中。生长融合后呈典型“峰谷征”。见图1。

图1.原代大鼠VSMC细胞形态学鉴定 ：普通光镜下细胞融合后呈“峰谷征”(×100)
2.2 24-乙酰泽泻醇A对Ox-LDL诱导的VSMCs MMP-9 mRNA表达的影响
空白对照组VSMCs存在着MMP-9mRNA的基础表达；加入Ox-LDL（ 50 mg／L）处理24 h后，MMP-9 mRNA的表达明显上调(P<0．05)。24-乙酰泽泻醇A(10ug/ml)预孵育VSMCs 1 h，则Ox-LDL诱导的VSMCs MMP-9 mRNA表达上调可部分抑制(P<0．05,图2)。GAPDH作为内参。

图2.VSMCs MMP-9 mRNA表达 *为P<0．05，与空白对照组比较；#为P<0．05，与Ox-LDL组比较。
2.3 24-乙酰泽泻醇A对Ox-LDL诱导的VSMCs MMP-9 蛋白表达的影响
与空白对照组相比，Ox-LDL（ 50 mg／L）刺激下VSMCs的MMP-9蛋白水平显著升高(P<0．05)。24-乙酰泽泻醇A(10ug/ml)预孵育VSMCs 1 h亦明显抑制Ox-LDL诱导的VSMCs的MMP-9的蛋白表达上调(P<0．01；图3）。β-actin作为内参。
图3.VSMCs MMP-9蛋白表达 *为P<0．05，与空白对照组比较；##为P<0．01，与Ox-LDL组比较。
3 讨论
泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis(Sam．)Juzep．的干燥块茎,功能利水渗湿、化浊降脂。泽泻中主要含有的三萜类成分为泽泻醇A，24-乙酰泽泻醇A，泽泻醇B及其23-乙酰化物等。从泽泻脂溶性部分分离的三萜类化合物被认为是降血脂的有效成分，其中以24-乙酰泽泻醇A作用最强[7]。以往的研究主要集中在24-乙酰泽泻醇A对降脂的作用方面,而对于其在抑制血管平滑肌细胞迁移方面的研究很少。
VSMC位于血管中膜，是血管中层唯一的细胞成分。生理条件下，VSMC通过收缩和舒张调节血管张力，通过分泌和释放血管调节因子维持血管正常功能。VSMC由中膜迁移到内膜下间隙并异常增殖是动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等疾病共同的细胞病理基础之一。而细胞外基质尤其是基底膜是VSMCs迁移必须克服的生理屏障, 基质金属蛋白酶是降解VSMCs基底膜基质的主要酶类。MMPs可以降解ECM，尤其MMP-2（明胶酶A）和MMP-9（明胶酶B）是降解基底膜Ⅳ型胶原最主要的MMPs[8]。曹冠群等研究表明锌指蛋白A20通过下调MMP-9的表达抑制Ox-LDL介导VSMCs的迁移作用[9]。其他众多的研究表明干扰MMP-9基因表达，能有效了抑制VSMCs的迁移[10，11]。本实验发现, Ox-LDL组的MMP-9表达水平较空白对照组有所升高, 而泽泻醇A(10ug/ml)组MMP-9的mRNA和蛋白表达水平较Ox-LDL组降低，且MMP-9 蛋白表达水平下降较mRNA显著，可能是由于MMP-9是一种分泌型蛋白，除我们检测的是细胞内的MMP-9蛋白，细胞培养基中还有分泌型MMP-9蛋白的缘故，但这些已可表明MMP-9表达增高可能促进血管平滑肌细胞迁移, 而24-乙酰泽泻醇A可抑制VSMCs迁移，其作用可能与抑制MMP-9的表达相关。
在总结既往相关研究结果的基础上加以分析，可得出24-乙酰泽泻醇A抑制VSMCs迁移的机制中，对MMP-9表达的负性影响是其中重要环节，为24-乙酰泽泻醇A防治动脉粥样硬化提供了重要的理论和实践依据。
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